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免疫印迹法检测抗52 000 SSA抗体分析
邓学新 张秀花 史艳萍 甘晓丹 唐福林
抗SSA(Ro)抗体是自身免疫性结缔组织病患者血清中常见的抗体中的一种，该抗体能与可提取性核抗原(ENA)中的蛋白质和小RNA复合形成的微粒反应。目前证实具有抗原性的SSA(Ro)有两种蛋白，其相对分子量分别为60
000和52 000，这些蛋白质与Y1、Y3、Y5和Y5小RNA形成复合体存在于细胞内。鉴于现在国内大多数医院普遍采用免疫印迹法(immunobloting test，IBT)检测抗ENA抗体，而所用试剂制备过程中诸如抗原处理、电泳凝胶分离和垂直转印等各种因素影响，导致IBT结果中出现了许多假阳性或假阴性结果与临床不符，造成误诊、漏诊屡见不鲜，本文采用IBT法检测了155例标本，同时与目前公认经典的免疫双扩散法(immunodiffusion
test，ID)相对照进行比较分析，以期纠正目前对IBT法检测抗ENA多肽抗体的模糊认识，旨在探讨仅有抗52 000多肽抗体是否表明抗SSA抗体阳性。
1 资料与方法
1.1 病例选择
本组62例结缔组织病(CTD)中，19例系统性红斑狼疮(SLE)，10例原发性舍格伦综合征(SS)，8例系统性硬化症(SSc)，5例类风湿关节炎(RA)，5例多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)，1例亚急性皮肤型狼疮(SCLE)，14例其他结缔组织病包括斯蒂尔病，骨关节炎(OA)，大动脉炎，脂膜炎等。以上疾病均符合传统的诊断标准。73例非CTD病人标本来源于协和医院门诊或住院病人，疾病诊断明确。20例正常人标本来源于协和医院血库健康献血者。
1.2 方法
1.2.1 IBT法：采用深圳恒佳生物试剂公司生产试剂盒，测定方法参照其说明书并略加改善，简要步骤如下：每一反应槽加稀释液1
ml，待测病人血清20 μl混合后37 ℃孵育30 min，清洗3遍后，加入0.5 ml稀释好的酶标二抗液(用稀释液作1∶50稀释)再次37 ℃孵育30 min，清洗3遍，加底物液A、B各0.5 ml，待条带显色清楚后加入0.2 mol/L H2SO4终止液停止显色反应，将显色条带与标准条带卡比照，每次检测同时作阳性对照。
1.2.2 ID法：采用经典的梅花孔，待测血清作原倍和1∶4、1∶16、1∶64系列稀释。所用抗原为人脾提取物。每次检测配以由美国SCRIPPS自身免疫病中心鉴定核实的抗SSA阳性血清作为标准对照。
2 结果
2.1 62例CTD、73例非CTD和20例正常人IBT法检测抗52 000 SSA抗体和ID法检测抗SSA抗体结果：IBT法阳性率为62.6%(97/155)，ID法检测抗SSA抗体阳性率为18.7%(29/155)，统计学分析两法有显著性差异(P＜0.001)。
2.2 IBT和ID法联合检测50例非CTD和20例正常人抗SSA和抗52
000多肽抗体的结果：IBT法检测的50例非CTD病人中有6例抗52 000多肽抗体阳性(12%)，20例正常人结果中也有6例(30%)抗52 000多肽抗体阳性，ID法发现无1例抗SSA抗体阳性，说明IBT法检测SSA多肽并非特异。
3 讨论
抗SSA抗体是抗ENA抗体族中常见的一种抗体，因SSA抗原中有60 000和52 000两种分子量蛋白，故抗SSA抗体相应有抗60 000和抗52 000两条多肽抗体；Francisco［1］检测563例结缔组织病发现：抗52
000 SSA抗体主要见于原发性舍格伦综合征(40.9%)，抗60 000 SSA抗体主要在系统性红斑狼疮出现(19.2%)。抗SSA抗体的检测主要采用Western-blot技术发展的IBT法、以及对流免疫电泳法、ID法等。国外现已采用ELISA法检测抗SSA抗体，国内由于缺乏提纯或重组的特异性较高的SSA抗原，故无ELISA试剂盒生产；加之国外商品ELISA试剂盒价格昂贵，使国内大多数医院采用价格便宜且敏感性较高的IBT法来检测抗ENA抗体。IBT法是将粗提ENA抗原先经聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，依据不同蛋白质所带电荷和分子量的不同在电场中分离出若干多肽条带，然后水平转印至硝酸纤维膜上，将膜切成细条，制成试剂盒而转运销售。整个过程有众多因素影响蛋白成分在膜上位置，诸如电压大小、电泳时间、温度、电转液的离子强度等。应该清楚同一种蛋白分子在膜上的位置并不恒定；另一方面，条带只是反应其具有特定的分子量和电荷等特性，并不能说明该条带成分的单一性［2］。由于临床实践中常有因抗52
000抗体阳性而诊为抗SSA抗体阳性，进一步诊为结缔组织病，造成误诊、误治。免疫双扩散法仍为当今比较经典的检测抗体的方法，特异性高。故本文对抗52 000多肽条带采用ID法进行验证，并结合临床，看其是否为抗SSA抗体。我们用IBT法测定了50例非CTD和20例正常人标本，结果发现抗52
000多肽抗体阳性率分别高达12%(6/50)和30%(6/20)，而经ID法证实SSA抗体均为阴性。国内曾经报道［3］对30例IBT法52 000多肽抗体阳性病例进行4～12个月追踪调查，发现只有15例为CTD疾病，其他均为非CTD，说明IBT中的抗52
000多肽抗体并不能证明即为抗SSA抗体。国内市售免疫印迹试剂盒均以兔胸腺作为抗原，而此抗原中不含有60 000多肽，故IBT只能检测到抗52 000抗体，这样IBT检测抗SSA抗体就不全面，我们用人脾提取物作为ID法中SSA抗原来源，由于富含SSA(60
000和52 000)抗原［4］，故比IBT法检测抗SSA抗体较为全面；同时，ID法简单、快捷、费用低廉、特异性高，目前国际上不少大医院仍采用ID法检测抗SSA抗体，我们建议临床检测抗SSA抗体时采用ID法，以免误诊和漏诊。
本文编辑：葛虹■
作者单位：邓学新（100730 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院风湿免疫科）
史艳萍（100730 中国医学科学院 中国协和医科大学
北京协和医院风湿免疫科）
甘晓丹（100730 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院风湿免疫科）
唐福林（100730 中国医学科学院 中国协和医科大学
北京协和医院风湿免疫科）
张秀花（大同矿务局第一职工医院内科)
参考文献：
［1］Francisco J,Margarita R,Milalgrosa E,et al.Heterogeneity of the anti-Ro (SSA) response in rheumatic disease.Rheumatology,1994,21:1450-1454.
［2］Leonard H.Sigal electrophoresis and western blot/immunoblot
analysis.J Clin Rheumatology,1996,2:209-214.
［3］甘晓丹，史艳萍，赵炎，等. 两种方法检测抗可提取性核抗原抗体的比较.中华医学检验杂志，1998，21：110-1111.
［4］甘晓丹，唐福林，史艳萍，等.
不同组织来源的可溶性核抗原(ENA)抗原性的比较.中国免疫学杂志，1992，8：240-243.
收稿日期：1999-06-18 |