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系统性红斑狼疮患者血清中抗55 000表皮抗原抗体
与狼疮带关系的初步探讨
王培光 张学军 杨森 杨春俊 王再兴
系统性红斑狼疮(SLE)是一种多系统受累的自身免疫性疾病，血清中存在多种自身抗体，特别是识别细胞核抗原成分的抗核抗体(ANA)和盐水可浸出的核抗原(ENA)抗体。然而关于SLE抗基底膜(BMZ)抗体研究不多。皮肤狼疮带实验(LBT)对SLE的诊断价值早已为国内外学者所肯定，然而关于其形成的机制目前尚未完全阐明。因此本文分别应用热分离法制备的人表皮BMZ提取物和牛胸腺提取物做为抗原免疫印迹检测及间接免疫荧光检查20例SLE患者血清，并同时行狼疮带实验(LBT)，探讨狼疮带形成的机制。
1 材料和方法
1.1 仪器和材料：GL-20G-Ⅱ型冷冻离心机，FD 201型稳流稳压电泳仪，DDY-Ⅲ40B型电泳槽，DYY-Ⅲ28A型电泳槽，DY-B1型脱色摇床，组织匀浆器，硝酸纤维膜(NC，Amersham产品)，Leica冰冻切片机。
1.2 病例选择：SLE
20例，男4例，女16例，年龄14～36岁，平均年龄26岁。SLE的诊断是根据ARA制定的标准。对照组：皮肌炎2例，均为女性，年龄为26岁和48岁；大疱性类天疱疮20例，男13例，女7例，年龄40～81岁，平均年龄56岁；正常人10例，男2例，女8例，年龄22～40岁，平均年龄30岁。
1.3 热分离表皮BMZ抗原的制备［1］：取自我院外科手术切除下来的正常皮肤，去除皮下脂肪，削至0.5
mm左右厚度，用预冷的PBS反复冲洗后切成2 cm×2 cm大小皮片，先放入37 ℃热分离缓冲液中10 min，快速冷却，轻轻分离表皮和真皮，表皮充分剪碎，置于组织匀浆器中，加入热分离表皮提取液(按每25 cm2表皮加入1
ml提取液)充分匀浆，匀浆物置于液氮中反复冻融10 min×3次，匀浆物以12 000 r/min，4 ℃离心30 min，吸取上清液，重复离心一次，吸取上清，分装，－30 ℃保存。
1.4 免疫印迹的测定［2］：采用7.5%分离胶和4%浓缩胶。表皮提取物经SDS-PAGE和转移电泳，将抗原转印至硝酸纤维膜(NC)上。NC置于0.05%
Tween-20%-3% BSA-PBS封闭1～2 h，切成3 mm宽，置于反应槽内，加入经血清稀释液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，含0.5 mol/L NaCl，0.5% BSA，0.3% Tween-20)1∶10稀释的待检血清，室温平缓摇动1 h，倾去反应液，用洗涤液(10 mmol/L Tris-HCl，pH
7.4，含0.5 mol/L NaCl，0.3% Tween-20)漂洗10 min×4次，加入按1/400稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体(Sigma产品)室温平摇1h，倾去反应液，用洗涤液漂洗10 min×4次，甩干后加入新鲜配制的DAB底物液(0.6 mg/ml DAB，0.03%
H2O2)，观察出现较明显区带后用双蒸水冲洗终止反应。
1.5 ENA多肽抗体的测定：ENA多肽抗体谱试剂盒由深圳爱利国科技开发公司提供。检测方法：患者血清用缓冲液1：50稀释加于印迹膜上，37
℃反应1 h，用含Tween-20的缓冲液冲洗3次后，与辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体反应1 h，用含Tween-20的缓冲液冲洗3次后，印迹膜与显色液反应。标准阳性抗体显色带由试剂盒内提供。
1.6 皮肤间接免疫荧光(IIF)检查：取正常人皮肤，OCT包埋，冰冻切片，厚度为6
μm，加入经0.1 mol/L PBS 1∶20稀释的SLE患者血清37 ℃ 30 min，用0.01 mol/L PBS漂洗3次，加入FITC标记的羊抗人IgG抗体(Sigma产品)，37 ℃ 30 min，然后用0.01 mol/L PBS漂洗3次，干燥后置于荧光显微镜下观察。
1.7 狼疮带实验(LBT)检查：切取SLE患者前臂非暴露部位的皮肤，OCT包埋，冰冻切片，厚度为6
μm，加入FITC标记的羊抗人IgG抗体(Sigma产品)，37 ℃ 30 min，然后用0.01 mol/L PBS漂洗3次，干燥后置于荧光显微镜下观察。
2 结果
2.1 免疫印迹检查结果：热分离法制备的人表皮抗原经SDS-PAGE、转移电泳及与SLE患者血清进行免疫印迹检测，结果发现，11/20例血清中IgG型自身抗体与55 000抗原发生特异性反应，大疱性类天疱疮血清与180
000抗原结合，皮肌炎和正常人血清不结合任何区带的抗原。
2.2 ENA多肽抗体谱的测定结果：20例SLE患者血清中，15例有Sm抗体，6例有RNP抗体，4例有SSA抗体，3例有SSB抗体；2例有核糖体抗体，未有Scl-70抗体和Jo-1抗体。
2.3 皮肤IIF检查结果：20例SLE患者均为阴性，皮肤BMZ处未有IgG线性沉积。
2.4 皮肤LBT检查结果：20例SLE患者均为阳性，皮肤BMZ见IgG抗体线性沉积，12例同时伴有IgM沉积。
3 讨论
本文应用热分离法制备的人表皮提取物与SLE患者血清免疫印迹检测，结果发现，11/20例血清中IgG型自身抗体结合55 000表皮抗原，皮肌炎、大疱性类天疱疮和正常人血清均不结合此抗原，因此人表皮提取物中55
000抗原为SLE自身抗体特异性靶抗原。在SLE ENA多肽抗体中，仅抗Jo-1抗体识别的靶抗原分子量与本文热分离的人表皮BMZ提取物中55 000抗原分子量相近，然而ENA多肽抗体谱检测结果表明，20例SLE患者血清中均不存在抗Jo-1抗体。汪新义［3］和翁孟武等［4］应用牛胸腺提取物做为抗原分别对58例和120例SLE进行免疫印迹分析均未发现抗Jo-1抗体。因此我们认为SLE患者血清中抗人表皮BMZ提取物中55
000抗原抗体不同于抗Jo-1抗体。LBT检查结果显示20例SLE患者全部阳性，皮肤BMZ见IgG抗体线性沉积，12例同时伴有IgM沉积。因此推测，本文SLE患者血清中抗人表皮提取物中55 000抗原抗体可能为抗BMZ抗体，而55 000抗原可能是皮肤BMZ的正常成分，并非是表皮细胞的核抗原成分。然而IIF检查结果全部阴性，推测可能与BMZ抗原未有充分暴露有关。Ishiakwa等［5］应用盐裂皮肤IIF和免疫印迹检测发现一些SLE患者血清中存在抗BMZ抗体，结合230
000 BMZ抗原。
现在普遍认为，SLE病人LBT阳性是由于血清中存在抗BMZ抗体或循环抗原-抗体复合物沉积在BMZ所致［6］。然而狼疮带形成是由于血清中抗BMZ抗体结合于皮肤BMZ还是由于外来循环抗原-抗体复合物沉积在BMZ或两种因素同时参与所致尚不清楚。从以上事实来看，SLE患者血清中抗BMZ抗体与BMZ中相应的抗原结合激活补体系统可能是狼疮带形成中一种重要的机制，抗人表皮BMZ提取物中55
000抗原可能与狼疮带形成密切相关。然而本文SLE自身抗体识别的55 000抗原是否真正为BMZ一种独立的成分，还有待于运用免疫亲和纯化、分子克隆和免疫电镜等技术进行深入的研究。
本文编辑：杨金萍
基金项目：安徽省自然科学基金资助课题 (97424005)
作者单位：王培光（230022 合肥，安徽医科大学第一附属医院皮肤科）
张学军（230022
合肥，安徽医科大学第一附属医院皮肤科）
杨森（230022 合肥，安徽医科大学第一附属医院皮肤科）
杨春俊（230022 合肥，安徽医科大学第一附属医院皮肤科）
王再兴（230022
合肥，安徽医科大学第一附属医院皮肤科）
参考文献：
［1］张学军，翁孟武，施守义.热分离法制备表皮下大疱病抗原.中华微生物和免疫学杂志，1994，14：416-418.
［2］张学军，翁孟武，施守义.免疫印迹检测大疱性类天疱疮抗体.中国免疫学杂志，1995，11：48-50.
［3］汪新义，程焕明，张发义，等.免疫印迹检测SLE患者血清ENA抗体与临床关系的研究.临床皮肤科杂志，1996，25：261-263.
［4］翁孟武，段西凌，侯爱琴，等.免疫印迹测定盐水可提取核抗原抗体.中华皮肤科杂志，1995，28：392-393.
［5］Ishiakwa
O,Zaw KK,Miyachi Y,et al.The presence of anti-basement zone antibodies in the sera of patients with non-bullous lupus erythematosus.Br J Dermatol,1997,136:222-226.
［6］翁孟武.皮肤直接荧光检查的临床意义.国外医学皮肤病分册，1983，9：74-75.
收稿日期：1999-06-21 |