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[2001]第0534号

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必须重视快速斑点免疫结合试验的质量控制

秦晓光

　　自80年代以来，快速斑点免疫结合试验(dot immunobinding assay, DIBA)，受到检验人员的重视，其技术发展很快，应用范围日益扩大。从药物的测定到传染病病原的抗原、抗体检测，激素检测，肿瘤标志物和心肌梗死生化标志物检测等等，覆盖面甚广。从文献上看，被研究可检测的项目不下于50种。半定量检测，同一膜上多项目的组合检测技术也日趋成熟，市场上推出的检测条、检测卡更是名目繁多。目前快速斑点免疫结合试验应用较广的主要是两种技术：斑点免疫层析试验(dot immunochromatography assay, DICA)及斑点免疫渗滤试验(dot immunofiltration assay, DIFA)，尤其前者应用最广。另外还有一个免疫酶斑点试验(immunoenzyme spot assay, IESA)，此技术的主要特点，是将抗体或抗原包被在硝酸纤维素膜等微孔薄膜上，而不是包被在聚苯乙烯反应板上，其他如加样、反应、洗涤、加标记结合物……等步骤与酶联免疫吸附测定(ELISA)相似，但其原理与DICA和DIFA并不完全相同，应注意区别。由于标记物最初为酶标，目前大多使用胶体金进行标记，因此文献上记载与市场上出售的检测条(卡)在名称上并未统一，如滴金法，斑点金免疫法，金标法等等，其试验技术可能是免疫层析试验，也可能是免疫渗滤试验，甚至有干脆称“一步法”的，这易与ELISA“一步法”混淆，因此我们在采用某一检测条(卡)时，有必要先弄清采用的究竟是哪一种技术。
　　斑点免疫结合试验由于其快速、操作简便、不需特殊设备、且可单份测定，受到了基层的欢迎。还由于某些检验项目患者可以自检，也受到了一些患者的欢迎。无疑斑点免疫结合试验的建立，是免疫检验技术的一大进步，它有着广泛的应用前景，同样也有着广阔的发展空间。
　　在进行DICA和DIFA时，遇到的主要问题是质量控制问题，这是亟待解决的问题。首先，由于目前对这类检测条(卡)还没有统一的质量标准及管理办法，因此各公司生产的产品质量不一，工作中遇到的问题有：敏感性不一，结果不够稳定，重复性不够满意，带现象的发生，临界值不统一等等，都给大家带来一定困惑。其中以敏感性而言，如乙肝表面抗原(HBsAg)检测，敏感性可相差数倍左右，其他项目检测和不同厂家的产品也有同样情况。有的产品厂家标志的敏感性与实测不符的情况也可遇到。本期刊出的《胶体金免疫层析法检测HBsAg的应用》一文，即从一个侧面反映了这一问题。其次还没有建立起有效的室内质控的方法，给质量保证带来不少问题。
　　由于DIBA应用越来越广泛，影响面大，因此加强这方面的质量控制越来越重要了。
　　首先对生产厂家来说，必须有严格的质量标准和质量鉴定。作为合格检测产品，至少应有下列质量指标：敏感性(或临界值)，特异性，重复性，测定范围，稳定性及与ELISA等公认检测方法对比结果等，望厂家能提供这方面资料。这些质量指标的含义大家是熟知的，而在DIBA中则有一些特殊情况。
　　1.敏感性是最基本的一个质量指标。因为这一试验目前仍以定性方式报告为主，敏感性的不一致，显然造成阴、阳性结果的不一，致使临床对结果难以解释。另外，敏感性的确定，也有需探讨之处。用一个标准品来确定敏感性，虽然无可非议，但工作中也遇到这样情况：待测物在同一水平(接近检测下限时)的不同标本中可以出现不同的结果。因此，如何保证绝大多数待测物浓度接近其检测下限时的标本能出现阳性结果，是需要慎重考虑的问题。而临床应用于特定目的，选用检测条(卡)时，也必须考虑敏感性这一问题。如献血员HBsAg的初筛，显然必须选用敏感性≤1 ng/ml的检测条(卡)，否则将造成血液的浪费及检测成本的增加。
　　2.有些检测项目(如甲胎蛋白、肌钙蛋白等)阴、阳性的界限是其正常参考值，这就不是单纯的敏感性的问题，而是“检测下限”或是阴性、阳性分界的临界值问题。由于标准不完全统一，已影响到一些检测结果的解释，并造成一些疾病诊断上的假阴性、假阳性问题，因此有必要统一标准，产品上也应注明临界值。
　　3.重复性的问题，往往与敏感性相关。在待测物浓度比较高时，不易发现重复性存在的问题，但在低浓度时(尤其在接近其检测下限时)就有可能发现呈色时间、呈色深浅的差异，甚至同一批检测条(卡)对同一个标本可以出现阳性，阴性两种结果，这可能由于检测条(卡)制备的工艺条件要求高，难以完全达到的缘故。因此要严格检测条(卡)制备工艺，而在重复性试验中，应有低浓度标准物进行测试。
　　4.关于检测上限也必须重视，因为在某些检测中已发现带现象，因而检测范围应列为质量指标之一。而这一指标目前还重视不够。
　　5.由于以上原因，在与公认的检测方法(如ELISA法)作临床标本对照时，必须有意识地安排一定数量高浓度和低浓度的标本，这对评价检测条(卡)的质量是十分必要的。
　　为保证质量，对于国家已规定必须批批检的检测试剂(如病毒性肝炎一类的检测试剂)，就应进行严格的批批检。希望有关部门能制定相应的规定。目前尚未规定批批检的检测条(卡)也应定期抽检。
　　对于临床检验工作来说，下列问题必须重视：
　　1.对于DIBA的原理及特点要有充分了解，方能正确使用这一技术，当出现问题时才能正确解释。
　　2.对所用的每一种检测条(卡)的质量要充分了解，根据临床使用目的选用检测条(卡)，不要使用质量不符合要求的检测条(卡)。
　　3.要逐步建立室内质控。目前有人片面以为“对照线”出现颜色，质量就得到保证，有的以为这是“质控线”，代替室内质控。其实“对照线”包被的是与标记结合物能直接结合的物质，它们之间的结合，不需要待测物参加，因此仅能作为试验过程是否有效的参考指标(如标记结合物是否失效，层析过程是否正常，被测标本中有无干扰物质等)。并不能反映敏感性，特异性、重复性等质量指标，对于日常的室内质控，特异性等指标难以完全做到，而由于重复性的优劣，检测条(卡)在保存期中质量的变化等等，敏感性的变化往往是一个最敏感的指标，也是最容易观察的一个指标。因此敏感性的检测应作为室内质控的手段之一。虽然敏感性的检测不能反映全部质量情况，但在保证结果的可比性方面有着重要作用。日常工作中，可以用一些质控物(其中应有一个低浓度的质控物)，定期或不定期对检测条(卡)进行检测，观察是否呈色，呈色的时间，呈色的深浅，作为检测条(卡)质量有无变化的指标，这是较容易做到的。当然质控物应该是可靠的，最好由临检中心提供，也希望厂家能提供合格的质控物，我们应该根据使用中发现的问题，建立质控方法，明确质控指标，积累质控经验，使室内质控进一步完善。
　　最后希望有关管理部门对这类产品要制定出相应的管理办法，建议临检中心也要重视这类试验的质量控制，提供质控物，开展室间质量评估，使这一技术能够在更可靠的基础上为患者服务。

作者单位：100028 北京，煤炭总医院检验科

(本文编辑：臧焰)

(收稿：1999-09-20　　修回：1999-09-24)

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